Le test des Comètes

histoire:

Cette technique fut mise au point en 1984 par Osting O et Johanson K dans le but de détecter les cassures doubles brins de l'ADN. La lyse et l'électrophorèse fut effectuées dans des conditions neutres et la coloration avec de l'acridine orange (l'acridine se lie à l'ADN et à l'ARN grâce à ses propriétés d'intercalation).
Elle fut ensuite optimisée par Singh et all en 1988 afin de détecter les cassures simples brins et les sites alcali-labiles. L'électrophorèse, dans ce cas présent, se réalise dans des conditions fortement alcalines afin de relaxer et de détendre l'ADN superenroulé.


Principe:

Le test des comètes ou Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE) est une technique d'électrophorèse sur microgel d'agarose. Il permet de mesurer les cassures induites directement par un agent génotoxique et indirectement lors des processus enzymatiques de réparation des dommages ou lors de processus secondaires defragmentation de l'ADN tel que l'apoptose.

Mode opératoire:

Les cellules après un contact avec un agent altérant la structure de l'ADN (isotopes, agents oxydants ou autres molécules toxiques) pendant un temps donné sont décollées de leur boite de pétri pour y être englobées dans un gel d'agarose et déposées sur une lame de microscope. Elles sont ensuites soumises à l'action d'un agent alcalin(pH 10)  qui a pour effet de lyser les cellules (destruction  des membranes, des protéines et des ARNs) et de libérer les noyaux. Ces derniers sont ensuite incubés dansun tampon d'électrophorèse  basique (pH 13) pour faciliter la dénaturation, la détorsion de l'hélice et l'exposition des sites sensibles aux agents alcalins. L'ADN ainsi relaché,  est soumis à une électrophorèse (de faible voltage et ampérage) puis révélé par addition d'un intercalant fluorescent (le Bromure d'éthydium).
Si l'ADN n'a pas été  endommagé (reste sous forme super enroulé) sera révélé sous forme d'une sphère compacte.
Si l'ADN a été endommagé, celui-ci présentera en plus des fragments simples et doubles brins (plus légers) qui migreront en dehors de cette sphère formant un "halo" d'ADN qui s'étirent en direction de l'anode et décrivent la queue de la comète.

avantages:

• Cette technique permet de quantifier d'une part les dommages causés à l'ADNpar divers agents toxiques et d'autre part la réparation des dommages dans les cellules eucaryotes ainsi  que dans quelques cellules procaryotes in vivo et in vitro.
• Technique non invasive.
• Technique sensible (détection d'environ  0,2 à 2 coupures par 10⁹ daltons).
• Les résultats sont obtenus en quelques heures  par rapport aux techniques conventionnelles.
• 50 à 100 cellules sont comptées par échantillon par comptage manuel ou en utilisant un logiciel.

inconvénients:

• Le débit de cette technique est bas, car une électrophorèse correspond à un type cellulaire / un agent toxique / une concentration.
• Les résultats ne peuvent être comparés que s'ils proviennent d'électrophorèses réalisées ensembles.

Exemples d'application:

• Evaluation des produits chimiques génotoxiques in vivo et in vitro.
• Etude sur la réparation de l'ADN (réparation par excision; Strand Break Repair).
• Etude sur les dommages causés à l'ADN (cassure simple brin; sites alcali-labile; réticulation de l'ADN).
• En éco-toxicologie: test utilisé pour surveiller des sols et étudier la toxicologie aquatique.
• Evaluation des polluants génotoxiques provenant de sites de déchets dangereux.
• Epidémiologie de l'homme:
  • Banque de sang.
  • Suivi de la radio et chimio-thérapie chez les patients cancéreux.
  • Banque de sperme.